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在GenomeStudio 软件中，当我们计算探针的甲基化水平时，提供了两个关键的预处理操作
Normalizetion
Subtract Background
Normalization 可选的值有none和control, none 表示不进行归一化，control 代表的时利用control 探针进行归一化。subtract Background 表示背景降噪。
归一化的算法
# 计算原始的红绿双通路信号强度Green <- getGreen(rgSet)
Red <- getRed(rgSet) # 提取450K芯片中用于Normalization的探针IDAT.controls <- getControlAddress(rgSet, controlType = c("NORM_A", "NORM_T"))
CG.controls <- getControlAddress(rgSet, controlType = c("NORM_C", "NORM_G"))# 以第一个样本为参照，计算其他样本相对该样本的差异倍数Green.avg <- colMeans(Green[CG.controls, , drop = FALSE])
Red.avg <- colMeans(Red[AT.controls, , drop = FALSE])
reference <- 1ref <- (Green.avg + Red.avg)[reference]/2Green.factor <- ref/Green.avg
Red.factor <- ref/Red.avg# 计算每个样本的系数，将原始的信号强度乘以这个系数，作为归一化的结果Green <- sweep(Green, 2, FUN = "*", Green.factor)
Red <- sweep(Red, 2, FUN = "*", Red.factor)# 将原始的信号强度替换成归一化之后的信号强度assay(rgSet, "Green") <- Green
assay(rgSet, "Red") <- Red从上面的代码可以看出来，control 的归一化算法实际上就是利用NORM系列探针，对每一个样本计算一个偏倚系数， 然后将原始的信号强度乘以这个系数，作为归一化的结果。
这个算法的思想比较简单，比如两个重复样本A和B, 其信号强度理论上是相同的，但是实际情况并不会完全相同，而是存在倍数关系，比如B 是A的1.5倍，为了将二者归一化到同一水平，将A 的信号强度乘以1.5就可以了。
在实际处理的时候，利用NOMR系列control 探针，以某一个样本为参照，计算其他样本相对ref的信号强度的差异倍数，然后除以差异倍数就将所有样本归一化到同一个水平了。
从这个算法的思想也可以看出，它可以很好的消除技术重复之间的差异。
背景矫正的算法
# 计算原始的红绿双通路信号强度Green <- getGreen(rgSet)
Red <- getRed(rgSet)# 提取450K芯片中的 NEGATIVE control探针IDNegControls <- getControlAddress(rgSet, controlType = "NEGATIVE")# 以Negative探针Green.bg <- apply(Green[NegControls, , drop = FALSE], 2, function(xx) sort(xx)[31])
Red.bg <- apply(Red[NegControls, , drop = FALSE], 2, function(xx) sort(xx)[31])
Green <- pmax(sweep(Green, 2, Green.bg), 0)
Red <- pmax(sweep(Red, 2, Red.bg), 0)# 将原始的信号强度替换成矫正之后的信号强度assay(rgSet, "Green") <- Green
assay(rgSet, "Red") <- Red背景降噪的算法，本质上都是从原始的信号强度中减去噪声的信号强度，GenomeStudio使用NEGATIVE探针的某个信号强度作为需要减去的噪声强度，上面的代码通过对NEGATIVE探针的信号强度排序之后，随机挑选了第31位点的信号强度作为噪声，然后在原始的信号强度中减去这部分噪声强度。
在减去噪声强度的同时，可能会出现最终的值小于零的情况，这里将最终小于零的值变成了0。
GenomeStudio的背景降噪算法的核心是利用NEGATIVE 探针的信号强度计算出一个统一的噪声强度，然后在原始的信号强度的基础上减去该噪声强度。
只有经过了包括背景降噪和归一化在内的预处理步骤直接，才可以进行后续的差异分析。