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点评 | 孙育杰(北京大学)、钟桂生(上海科技大学)责编 | 兮显微镜是人类最伟大的发明之一，自17世纪列文虎克把显微镜应用于微生物研究以来，人们就一直孜孜不倦的追求显微镜分辨率的提高，以期待看到更微小的细胞结构，了解生命活动的本质。但由于光学显微镜分辨率受衍射现象限制，在进入本世纪前一直没有取得突破。进入21世纪以来多种超高分辨率荧光成像技术被提出，新型超高分辨率显微镜产品也如雨后春笋般出现，打破了光学分辨率的极限, 将光学分辨率提高到几十纳米的尺度, 可以用来观察精细的亚细胞结构和生物分子定位信息，被广泛地应用于生物学研究中，相关工作也因此获得了2014年的诺贝尔化学奖。但把光学显微镜分辨率进一步提高到分子水平，以观察纳米尺度的亚细胞结构乃至单个生物大分子内的结构仍是巨大的挑战。2019年9月9日，中国科学院生物物理研究所徐涛院士领衔的生命科学仪器研制中心团队(共同一作为谷陆生、李媛媛和张淑文)在Nature Methods杂志发表了题为“Molecular resolution imaging by repetitive opticalselective exposure”的论文，提出了一种基于干涉定位成像的新技术，并据此研制出新型的ROSE单分子干涉定位显微镜(Repetitive Optical Selective Exposure)，可以分辨点距为5 nm的DNA origami结构，把显微镜的分辨率提升到3 nm以内的分子尺度，单分子定位精度接近1 nm。
ROSE采用6个不同方向和相位的干涉条纹去激发荧光分子，荧光分子的发光强度与其所处条纹的相位相关，因此可以通过荧光分子强度与干涉条纹的相位关系来判断荧光分子的精确位置信息。该方法可类比于GPS定位，GPS定位即是通过几颗卫星到GPS信号源的距离来判断信号源的精确位置。这种方法的理论定位精度是传统方法的2.4倍。
图1 左侧，传统质心拟合定位方法，右侧，利用干涉条纹定位的ROSE方法由于单分子发光时存在的闪烁以及漂白会对亮度产生影响，ROSE技术对干涉条纹切换速度和成像数据读出速度都提出了巨大的挑战。团队创造性的设计了基于电光调制器的干涉条纹快速切换激发光路，以及基于谐振振镜扫描的6组共轭成像光路，二者的同步实现了高达8 kHz的分时成像，确保在相机的单次曝光时间里把每个单分子发光状态均匀分配给6个干涉条纹，避免了荧光分子发光能力波动对定位精度的干扰。通过设计不同荧光位点间距的DNA origami阵列，团队把该技术与传统的质心拟合方法进行了全面对比，发现在相同光子数条件下该技术能清晰解析20 nm和 10 nm的阵列结构，而传统方法只能解析20 nm阵列。团队进一步验证了该技术可以解析5 nm的阵列，证明该技术已经达到了分子水平的分辨率。单分子定位数据表明该技术已经实现接近1 nm的定位精度。
孙育杰(北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心研究员)超分辨荧光显微成像技术自二十世纪九十年代萌芽，用了十年左右的时间实现技术突破，再到2014年获得诺贝尔化学奖，已经成为生命科学乃至化学和材料方面研究的重要工具。超分辨技术通过不同原理“打破”了光学成像的衍射极限。其中基于单分子定位和重构原理的STORM/PALM技术是目前超分辨技术中空间分辨率最高的方法。由于单分子定位的精度主要取决于探测器采集到的荧光分子的光子数，因此为了进一步提高其空间分辨率，近年来多个研究组通过低温成像、双物镜成像、新探针开发以及抗漂白试剂等手段来增加荧光分子的光子数，以提高其定位精度，但单分子定位的原理一直没有被突破。“重复光学选择性曝光”技术(Repetitive Optical Selective Exposure, ROSE)采用单分子干涉测量的创新方法，在相同光子数条件下，定位精度可以达到质心拟合方法2倍以上，适用于纳米量级亚细胞结构的分析。ROSE采用电光调制器(EOM)和谐振振镜同步结合的新方法，把高速循环产生的干涉条纹和相机上6个子区域一一对应，利用一个频率为4K的谐振振镜把上述6种干涉条纹分别成像到两个相机的6个子区域。最大化避免因荧光分子闪烁、漂白、发光周期短导致的定位误差，不但可以实现DNA-PAINT(points accumulation for imaging in nanoscale topography)成像，还可兼容荧光分子发光持续时间较短的PALM、STORM等技术。文章展示了利用ROSE技术解析间隔5nm的结构，已经很接近分子分辨率(一个GFP荧光蛋白的直径约为3nm)。未来，通过进一步改进ROSE技术，如使用更小的扫描范围、更高的激光功率和更高数值孔径的物镜，可控荧光基团，以及采集更多图像等，ROSE的空间分辨率还可获得进一步提高。同时，ROSE也可以扩展到三维成像。因此，这一新型超分辨成像技术将有望在分子尺度对生物大分子动力学和结构实现解析。专家点评钟桂生(上海科技大学 生命科学与技术学院助理教授，超分辨显微成像专家)光学显微成像技术在生命科学、生物医学、临床医学诊断和材料科学等众多领域有着非常广泛的应用。但光学衍射极限的存在，使得传统光学显微镜无法对纳米尺度的物质及生命活动进行观察，极大限制科学研究和医学的发展。近年来，突破光学衍射极限的超分辨成像技术的不断发展，显微成像分辨率得到不同程度的提高。目前在基于不同原理的各种超高分辨率显微镜中，随机光学重构显微镜(Stochastic opticalreconstruction microscopy, STORM) 分辨率最高，可达几十纳米【1】。空间分辨率的提高有助于研究清楚蛋白的细胞内结构。肌动蛋白是细胞的骨架，在细胞生物学里面已经研究很多年，但是其在神经元里面的精细结构还是用STORM近期观察到的【2】(图一)，表明技术上的突破可以直接获取新的知识。如何进一步提高空间分辨率到10纳米以内，以便更为精确的观察细胞内蛋白以及蛋白复合物的结构非常重要和迫切，因此提高空间分辨率还是成像领域待解决的一个重要难题。
图一 神经轴突中肌动蛋白STORM成像目前由几种方式可以提高STORM的空间分辨率，开发高性能的荧光分子或者荧光蛋白；在同样的荧光分子下，如何进一步的提高荧光单分子的空间定位，目前常用的是高斯拟合，也有用双物镜的方式可以尽可能收集到更多的光子【3】，因此提高空间分辨率。中科院生物物理研究所的纪伟和徐涛院士课题组紧密合作，在如何提高荧光单分子定位方面做出了突破性的进展，把成像空间分辨率提高到3纳米左右，这项原创性的工作近期发表在著名的Nature Methods杂志上。
图二 ROSE的工作原理和验证。徐涛院士及其合作者利用干涉定位新技术，巧妙在重复成像的基础上结合传统的高斯拟合(图二)，在同样的荧光分子实验条件下，利用ROSE的单分子定位比传统方法提高了两倍左右。作者进一步在DNA origami和细胞样本上对比了ROSE和传统的高斯拟合方法。可以明显看出ROSE在两种不同的样本下面都具有很大的优势(图三)。
图三在两种不同样本情况下ROSE比Centriod fitting成像优势明显值得一提的是，超分辨显微技术在具体应用中存在着许多难题，基于不同原理的各种显微镜仍然有着各自的局限性，如何突破这些局限，并进一步提高时间、空间分辨率依然是生物物理学及光学的研究热点。ROSE方法的问世相信会在细胞生物研究中发挥重大影响，不过要完全实现其应用潜力，还是需要克服一些因素，比如荧光标记上面需要更多的要求，比如这个成像仪器的普适性，一般的生物科研人员能不能方便操作。随着更多的物理和光学科学家来改进、完善甚至改革这一技术领域，相信ROSE能为生物甚至医学方面的研究发挥更大的作用。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-019-0544-2
ROSE采用6个不同方向和相位的干涉条纹去激发荧光分子，荧光分子的发光强度与其所处条纹的相位相关，因此可以通过荧光分子强度与干涉条纹的相位关系来判断荧光分子的精确位置信息。该方法可类比于GPS定位，GPS定位即是通过几颗卫星到GPS信号源的距离来判断信号源的精确位置。这种方法的理论定位精度是传统方法的2.4倍。图1 左侧，传统质心拟合定位方法，右侧，利用干涉条纹定位的ROSE方法由于单分子发光时存在的闪烁以及漂白会对亮度产生影响，ROSE技术对干涉条纹切换速度和成像数据读出速度都提出了巨大的挑战。团队创造性的设计了基于电光调制器的干涉条纹快速切换激发光路，以及基于谐振振镜扫描的6组共轭成像光路，二者的同步实现了高达8 kHz的分时成像，确保在相机的单次曝光时间里把每个单分子发光状态均匀分配给6个干涉条纹，避免了荧光分子发光能力波动对定位精度的干扰。通过设计不同荧光位点间距的DNA origami阵列，团队把该技术与传统的质心拟合方法进行了全面对比，发现在相同光子数条件下该技术能清晰解析20 nm和 10 nm的阵列结构，而传统方法只能解析20 nm阵列。团队进一步验证了该技术可以解析5 nm的阵列，证明该技术已经达到了分子水平的分辨率。单分子定位数据表明该技术已经实现接近1 nm的定位精度。图2 不同荧光位点间距的DNA origami成像，ROSE技术与传统的质心拟合方法进行对比验证，scale bars，上50 nm，下25 nm。
利用ROSE技术，团队还对细胞纳米结构进行了解析，并与传统的定位技术做了对比。结果显示ROSE在解析免疫标记的微管空心状结构、CCP的空心状结构以及较致密的细胞骨架等细胞精细结构更具优势。图3 鬼笔环肽标记的微丝成像，ROSE技术与传统的质心拟合方法进行对比验证，scale bars，上1 µm，下500 nm。
中国科学院生物物理研究所仪器研制中心团队近年来一直聚焦于显微成像仪器设备和技术方法的开发。团队先后研制了偏振单分子干涉成像、冷冻单分子定位成像以及超分辨光电融合成像系统。利用这些新型仪器设备开发了新的超分辨显微成像算法、探针和技术，并广泛应用于细胞生物学研究，支撑团队和合作者在该领域取得了系统性成果产出，并申请多项专利。所谓“所见即所得”，ROSE显微镜为生命科学的研究提供了更强有力的观察手段，具有广泛的应用前景，非常适合于细胞纳米结构的解析与高精度分子定位的研究，其接近1 nm的定位精度也可满足部分生物大分子内部结构解析和动态变化的研究。我们期待该技术的持续发展，开发出具有更高时空间分辨率的超分辨成像方法，进一步推进光学显微镜分辨率的极限。专家点评孙育杰(北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心研究员)超分辨荧光显微成像技术自二十世纪九十年代萌芽，用了十年左右的时间实现技术突破，再到2014年获得诺贝尔化学奖，已经成为生命科学乃至化学和材料方面研究的重要工具。超分辨技术通过不同原理“打破”了光学成像的衍射极限。其中基于单分子定位和重构原理的STORM/PALM技术是目前超分辨技术中空间分辨率最高的方法。由于单分子定位的精度主要取决于探测器采集到的荧光分子的光子数，因此为了进一步提高其空间分辨率，近年来多个研究组通过低温成像、双物镜成像、新探针开发以及抗漂白试剂等手段来增加荧光分子的光子数，以提高其定位精度，但单分子定位的原理一直没有被突破。“重复光学选择性曝光”技术(Repetitive Optical Selective Exposure, ROSE)采用单分子干涉测量的创新方法，在相同光子数条件下，定位精度可以达到质心拟合方法2倍以上，适用于纳米量级亚细胞结构的分析。ROSE采用电光调制器(EOM)和谐振振镜同步结合的新方法，把高速循环产生的干涉条纹和相机上6个子区域一一对应，利用一个频率为4K的谐振振镜把上述6种干涉条纹分别成像到两个相机的6个子区域。最大化避免因荧光分子闪烁、漂白、发光周期短导致的定位误差，不但可以实现DNA-PAINT(points accumulation for imaging in nanoscale topography)成像，还可兼容荧光分子发光持续时间较短的PALM、STORM等技术。文章展示了利用ROSE技术解析间隔5nm的结构，已经很接近分子分辨率(一个GFP荧光蛋白的直径约为3nm)。未来，通过进一步改进ROSE技术，如使用更小的扫描范围、更高的激光功率和更高数值孔径的物镜，可控荧光基团，以及采集更多图像等，ROSE的空间分辨率还可获得进一步提高。同时，ROSE也可以扩展到三维成像。因此，这一新型超分辨成像技术将有望在分子尺度对生物大分子动力学和结构实现解析。专家点评钟桂生(上海科技大学 生命科学与技术学院助理教授，超分辨显微成像专家)光学显微成像技术在生命科学、生物医学、临床医学诊断和材料科学等众多领域有着非常广泛的应用。但光学衍射极限的存在，使得传统光学显微镜无法对纳米尺度的物质及生命活动进行观察，极大限制科学研究和医学的发展。近年来，突破光学衍射极限的超分辨成像技术的不断发展，显微成像分辨率得到不同程度的提高。目前在基于不同原理的各种超高分辨率显微镜中，随机光学重构显微镜(Stochastic opticalreconstruction microscopy, STORM) 分辨率最高，可达几十纳米【1】。空间分辨率的提高有助于研究清楚蛋白的细胞内结构。肌动蛋白是细胞的骨架，在细胞生物学里面已经研究很多年，但是其在神经元里面的精细结构还是用STORM近期观察到的【2】(图一)，表明技术上的突破可以直接获取新的知识。如何进一步提高空间分辨率到10纳米以内，以便更为精确的观察细胞内蛋白以及蛋白复合物的结构非常重要和迫切，因此提高空间分辨率还是成像领域待解决的一个重要难题。图一 神经轴突中肌动蛋白STORM成像目前由几种方式可以提高STORM的空间分辨率，开发高性能的荧光分子或者荧光蛋白；在同样的荧光分子下，如何进一步的提高荧光单分子的空间定位，目前常用的是高斯拟合，也有用双物镜的方式可以尽可能收集到更多的光子【3】，因此提高空间分辨率。中科院生物物理研究所的纪伟和徐涛院士课题组紧密合作，在如何提高荧光单分子定位方面做出了突破性的进展，把成像空间分辨率提高到3纳米左右，这项原创性的工作近期发表在著名的Nature Methods杂志上。图二 ROSE的工作原理和验证。徐涛院士及其合作者利用干涉定位新技术，巧妙在重复成像的基础上结合传统的高斯拟合(图二)，在同样的荧光分子实验条件下，利用ROSE的单分子定位比传统方法提高了两倍左右。作者进一步在DNA origami和细胞样本上对比了ROSE和传统的高斯拟合方法。可以明显看出ROSE在两种不同的样本下面都具有很大的优势(图三)。图三在两种不同样本情况下ROSE比Centriod fitting成像优势明显值得一提的是，超分辨显微技术在具体应用中存在着许多难题，基于不同原理的各种显微镜仍然有着各自的局限性，如何突破这些局限，并进一步提高时间、空间分辨率依然是生物物理学及光学的研究热点。ROSE方法的问世相信会在细胞生物研究中发挥重大影响，不过要完全实现其应用潜力，还是需要克服一些因素，比如荧光标记上面需要更多的要求，比如这个成像仪器的普适性，一般的生物科研人员能不能方便操作。随着更多的物理和光学科学家来改进、完善甚至改革这一技术领域，相信ROSE能为生物甚至医学方面的研究发挥更大的作用。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-019-0544-2参考文献
1. Rust,M.J., Bates, M., and Zhuang, X. (2006). Sub-diffraction-limit imaging bystochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods 3, 793-795.2. Xu, K.,Zhong, G.S., and Zhuang, X.W. (2013). Actin, Spectrin, and Associated ProteinsForm a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science 339, 452-456.3. Xu, K., Babcock, H.P., and Zhuang, X. (2012).Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actincytoskeleton. Nat Methods 9, 185-188.